叶绿素a与叶绿素b含量的测定 实验目的和意义 叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。 实验原理 叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。 A663=82.04Ca+9.27Cb　　（1） A645=16.75Ca+45.60Cb　 （2） 公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27　分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。即混合液在某一波长下的光吸收等于各组分在此波长下的光吸收之和。 将上式整理，可以得到下式： Ca=0.0127A663-0.00269A645　　（3） Cb=0.0229A645-0.00468A663　　（4） 将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为： Ca=12.7A663-2.69A645　　（5） Cb=22.9A645-4.68A663　　（6） CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645　　（7） 　　CT为叶绿素的总浓度 实验仪器及材料 实验材料： 菠菜或其它绿色植物 实验仪器及试剂： UV-1700分光光度计；天平；剪刀；打孔器；研钵；移液管；漏斗；量筒；培养皿；滤纸；丙酮；石英砂；CaCO3； 实验步骤 提取叶绿素 选取有代表性的菠菜叶片数张，于天平上称取0.5g，（也可用打孔器打取一定数量的叶圆片，计算总的叶面积），剪碎后置于研体中，加入5ml 80%丙酮，少许CaCO3和石英砂。仔细研磨成匀浆，用滤斗过滤到10ml量筒中，注意在研钵中加入少量80%丙酮将研钵洗净，一并转入研钵中过滤到量筒内，并定容至10ml。将量筒内的提取液混匀，用移液管小心抽取5ml转入25ml量筒中，再加入80%丙酮定容至25ml（最终植物材料与提取液的比例为W：V＝0.5：50＝1：100，叶色深的植物材料比例要稀释到1：200）。 测量光吸收 利用722分光光度计或UV1700分光光度计，分别测定叶绿素提取液在645nm和663nm下的吸光度。 结果分析 将测得的数值代入到公式（5）（6）（7）中，计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的浓度。最后要计算出单位叶片鲜重中叶绿素的含量： 叶绿素a含量(mg/g鲜重)＝Ca×50ml（总体积数）×1ml/1000ml/L ÷0.5g=0.1Ca 叶绿素b含量(mg/g鲜重)＝0.1Cb 总叶绿素含量(mg/g鲜重)＝0.1CT 讨论： 1． 叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰，为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量。 2． 计算叶绿素a与叶绿素b含量的比值，可以得到什么结论？ 3． 比较阳生植物和阴生植物的叶绿素a和叶绿素b的含量以及比例，可以得到什么结论